En 1882, fue aceptada en la Escuela Nacional de Medicina. Al ser la única mujer y la primera en cursar esta carrera, Montoya se enfrentó a una serie de críticas y obstáculos por parte de la sociedad y de sus compañeros, desde la baja de su carrera así como las objeciones para hacer su examen profesional porque las actas oficiales decían "alumnos" y no "alumnas".
No obstante su determinación de estudiar propició que le escribiera al presidente de esa época, Porfirio Díaz, quien le facilitó cursar las materias que no le validaban, así como enviar una solicitud a la Cámara de Diputados para que se actualizaran los estatutos de la Escuela Nacional de Medicina. Finalmente, el 24 de agosto de 1887, Matilde Montoya logró ser la primer mujer médica en México.